Морские губки для бионанотехнологий

 Лауреаты премии имени выдающихся учёных

В прошлом году кандидатам биологических наук Юрию Николаевичу ШКРЫЛЮ, ведущему научному сотруднику лаборатории бионанотехнологий и биомедицины, доценту, и Галине Николаевне ВЕРЕМЕЙЧИК, старшему научному сотруднику лаборатории биоинженерии (ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН) была присуждена премия имени академика ВАСХНИЛ Б.А. Неунылова за цикл работ «Изучение и моделирование процессов биосилификации у морских губок».

Юрий Николаевич ШКРЫЛЬ

Галина Николаевна ВЕРЕМЕЙЧИК

Юрий Николаевич Шкрыль рассказал нам о задачах цикла работ, исследованиях, выполненных в рамках проекта; как и в каких областях могут быть использованы их результаты, могут ли они иметь практическое значение, а также о том, какие исследования планируются на ближайшие годы.

Многоликий кремний

Цикл работ посвящён исследованию фундаментального механизма биосилификации у морских губок как научной основы создания новых биомиметических материалов. Биомиметическая нанотехнология – это молодое, стремительно развивающееся направление науки, в котором получение новых наноструктурированных объектов основано на воспроизведении или имитации принципов различных биологических процессов. На молекулярном уровне основой данной технологии является использование биополимеров, катализирующих нуклеацию и рост первичных нанокристаллов, которые в свою очередь формируют на макроуровне определенные структуры с необычными свойствами. В ряде случаев каталитические и морфогенетические характеристики таких биомолекул можно имитировать с помощью синтетических соединений. В совокупности, биомиметические подходы позволяют получать биосовместимые нанокомпозитные материалы для различных приложений бионанотехнологии. Работа в данной области охватывает широкий спектр исследований, однако значительное место в них занимает изучение процессов биоминерализации в живых организмах. Одним из частных примеров биоминерализации является формирование структур на основе кремнезёма – биосилификация. Кремний по распространенности в земной коре является вторым (после кислорода) элементом, хотя в живой природе встречается значительно реже, однако играет существенную роль в физиологии животных и растений. Биогенный кремнезём служит основным компонентом створок диатомовых водорослей, спикул губок, режущих кромок растений; эфиры ортокремниевой кислоты входят в состав фосфолипидов, белков и пектинов. Как правило, лабораторные способы получения разнообразных структур на основе кремния основаны на использовании экстремальных значений pH и температуры, тогда как в биологических объектах биосиликаты определённой формы образуются в условиях окружающей среды. Так, скелет губок построен из особых кремниевых образований – спикул. Формирование спикул основано на реакции поликонденсации кремниевой кислоты, катализируемой белками силикатеинами из семейства цистеиновых протеаз. Как нативные (выделенные непосредственно из спикул губок), так и рекомбинатные (полученные путем гетерологичной экспрессии кодирующих последовательностей ДНК в альтернативных биообъектах, чаще бактериях) силикатеины обладают способностью к поликонденсации различных соединений кремния, таких как кремниевая кислота и её соли, кремнийорганические производные, с образованием наноструктур в условиях in vitro. Это свойство позволяет разрабатывать биомиметические технологии получения нанокремниевых структур с определенными характеристиками при обычных условиях.

«Один в поле не воин»

Исследования в данном направлении мы начали ещё в 2007 году в рамках комплексной программы развития нанотехнологий в ДВО РАН под руководством академика Ю.Н. Кульчина (ИАПУ ДВО РАН). Физиков интересовали уникальные фотонно-кристаллические свойства спикул губок и других кремниевых нанокомпозитов. Возникла идея подключить к работе химиков и биологов, чтобы научиться воспроизводить свойства биоминералов в искусственных условиях для развития технологии создания новых материалов для опто- и микроэлектроники. От ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН работой руководил член-корреспондент РАН В.П. Булгаков. ТИБОХ ДВО РАН был представлен сотрудниками лаборатории морской биохимии под руководством кандидата биологических наук В.А. Рассказова. От ИХ ДВО РАН с нами работали сотрудники лаборатории коллоидных систем и межфазовых процессов под руководством члена-корреспондента РАН Ю.А. Щипунова. В ИАПУ ДВО РАН мы сотрудничали с лабораторией физических методов мониторинга природных и техногенных объектов (руководитель – доктор биологических наук С.С. Вознесенский). Сбор и идентификацию морских губок осуществлял В.Б. Красохин (ТИБОХ ДВО РАН). Это если в общем, а так на разных этапах в проекте участвовали самые разные специалисты, за что всем им, пользуясь случаем, хотелось бы выразить огромную благодарность.

В самом начале мы столкнулись с трудностью идентификации генов силикатеинов из выбранных видов губок: объекты новые для науки, зацепиться было практически не за что, так как на тот момент известные последовательности силикатеинов у морских губок можно было пересчитать по пальцам. Гены собирали буквально по крупицам. Прежде всего, изучили семейство генов силикатеинов у демоспонгиевых губок, спикульной (Latrunculia oparinae) и бесспикульной (Acanthodendrilla sp.). Тогда мы впервые доказали существование множества форм силикатеинов у морских губок: ранее считалось что их всего две (альфа и бета), тогда как мы, в дополнение к бета-форме, обнаружили сразу четыре изоформы альфа-силикатеина.

Однако основная интрига того времени заключалась в выявлении молекулярных детерминант спикулогенеза у стеклянных губок. Существовали косвенные данные, свидетельствующие о том, что эти удивительные губки также содержат в своих гигантских спикулах силикатеин-подобные белки, но на генетическом уровне найти их никто не мог. С точки зрения физических свойств, именно спикулы стеклянных морских губок были особенно интересны для нанофотоники. В результате упорной работы в 2011 году мы опубликовали данные по анализу транскриптов сразу трёх видов стеклянных губок, среди которых у одной – Aulosaccus schulzei, была обнаружена последовательность силикатеин-подобного белка. По сути, найденный ген стал первой в мире полноразмерной последовательностью силикатеина у шестилучевых губок. Наш научный конкурент – профессор Мюллер, который до этого уже много лет исследовал силикатеины, лишь незначительно опередил нас. И то, его команде удалось идентифицировать только часть гена силикатеина стеклянной губки, так что мы считаем себя в этом отношении первооткрывателями.

Дальнейшее исследование было направлено на получение рекомбинантных силикатеинов в условиях in vitro и изучение их активности. Нам удалось подобрать условия, при которых силикатеин катализирует образование мономорфных гексатетраэдрических кристаллов кремнезёма, тогда как обычно исследователи получали структуры аморфной природы. Способность к поликонденсации была также продемонстрирована нами и для катепсина губок – белка, гомологичного силикатеинам, реакционная способность которого оставалась не изучена. Ещё одной работой, которая вошла в цикл, стало исследование особенности формирования наночастиц металлов с использованием клеточной культуры растений табака, экспрессирующей наш силикатеин. Оказалось, что рекомбинантный белок активировал восстановительный потенциал клеток почти в четыре раза. На данную разработку мы даже получили патент. Стоит отметить, что в этой работе нами впервые была получена эукариотическая система экспрессии рекомбинантного силикатеина на основе трансгенных растений и их клеточных культур. Таким образом, в целом серия работ представляет комплексное исследование, в котором изучение молекулярных основ формирования спикул у морских губок сочетается с разработкой биомиметической технологии использования этого процесса для бионанотехнологий.

Фундаментальное значение и практическое применение результатов работ

В первую очередь, наши работы имеют фундаментальное значение для понимания молекулярных механизмов формирования спикул у морских губок. Однако результаты имеют и практическое применение, поскольку показывают перспективность использования рекомбинантных силикатеинов и силикатеин-подобных белков для получения наноструктур in vitro. Соединения кремния используются в таких отраслях промышленности, как оптика, электроника и вычислительная техника. При этом физические методы получения кристаллических наноструктур на основе кремния является трудоёмкой и дорогой задачей. Кроме того, эти белки катализируют не только синтез силикатов, но также и полупроводниковых материалов на основе оксидов металлов TiO₂, ZrO₂, Ga₂O₃, способны вызывать образование наночастиц золота и биметаллических нанокристаллов фтортитаната бария. С помощью силикатеинов можно получать нанотрубки, нановолокна или наноплёнки как на основе кремнезёма, так и других соединений.

Признание получено, что делать дальше?

Сейчас работа в этой области ведётся нами уже не так активно, как раньше. В ближайшие годы мы планируем акцентировать внимание на исследованиях в области молекулярной и системной биологии растений, сельскохозяйственной биотехнологии, генной и геномной регуляции метаболических процессов в различных перспективных биообъектах. Однако совсем забрасывать тематику биомиметики тоже не станем. Недавно мы закончили исследование по оптимизации бактериальной системы экспрессии рекомбинантных силикатеинов. Эти белки далеко не самые простые ферменты для исследования, склонны к спонтанной конъюгации, и их получение в значительном количестве является нетривиальной задачей. После публикации по исследованию рекомбинантого белка нам стали поступать письма от коллег со всего мира с просьбой помочь советом по их получению в бактериях, так что новая работа, безусловно, будет востребована в научной среде. Кроме того, мы пытаемся воссоздать в условиях in vitro более естественный процесс биосилификации с участием не одного белка, как это делают в большинстве работ, а сразу с несколькими изоформами альфа- и бета-силикатеинов. Испытываем новые водорастворимые предшественники биосилификации и пытаемся применить наши наработки для получения оптических биосенсоров. Не так давно в тематику пришли новые молодые учёные, так что есть надежда на преемственность исследований, новые идеи и открытия.

Стоит отметить, что сложившаяся более десяти лет назад «кремниевая» научная кооперация с коллегами из ИАПУ сейчас воплощается уже в новом междисциплинарном исследовании – агробиофотонике. Задачей проекта является изучение фундаментальных принципов светового стимулирования роста растений как в норме, так и в условиях стресса, что в перспективе поможет отечественному сельскому хозяйству увеличить производство продовольствия. Но это уже будет другая история.

Фото и иллюстрации – из личного архива Юрия ШКРЫЛЯ